Informacje techniczne
Przeciwciała wtórne Jackson ImmunoResearch pozyskiwane są z surowicy poprzez oczyszczanie metodą chromatografii powinowactwa wykorzystując antygeny sprzężone ze złożem agarozowym. Odzyskiwanie przeciwciał następuje w wyniku procesu elucji. Niesprzężone przeciwciała są dostarczane w buforze fosforanowym pozbawionym stabilizatorów i konserwantów, natomiast sprzężone są liofilizowane w buforze fosforanowym zawierającym stabilizatory i konserwanty, za wyjątkiem koniugatów peroksydazy chrzanowej.
Przeciwciała oczyszczane metodą chromatografii powinowactwa dostępne są w trzech podstawowych formatach:
- całe immunoglobuliny
- fragmenty F(ab’)2
- fragmenty Fab
Całe immunoglobuliny są izolowane z surowicy za pomocą chromatografii powinowactwa w postaci nienaruszonych cząsteczek. Posiadają zarówno region Fc, jak i dwa regiony Fab wiążące antygen. Średnia masa cząsteczkowa oceniana jest na około 160 kDa. Całe immunoglobuliny są wykorzystywane do większości procedur immunodetekcji ze względu na największą efektywność.
Fragmenty F(ab’)2 są wytwarzane przez trawienie pepsyną całych przeciwciał IgG w celu usunięcia większości regionu Fc, pozostawiając nienaruszony region zawiasowy. Fragmenty F(ab’)2 mają dwa miejsca wiążące antygen, a ich średnia masa cząsteczkowa wynosi około 110 kDa. Fragmenty F(ab’)2 używane są w sytuacjach, w których należy unikać wiązania przeciwciał do receptorów Fc żyjących komórek lub do Białka A i Białka G.
Należy jednak pamiętać, iż użycie całych immunoglobulin klasy G może spowodować wystąpienie wiązania przeciwciał pierwotnych do receptorów Fc, tworząc tło niezależne od formy przeciwciała wtórnego. W celu zablokowania wiązania całych przeciwciał pierwotnych i wtórnych do receptorów Fc , komórki należy inkubować w buforze zawierającym 5% normalnej surowicy pochodzącej z tego samego gatunku co gospodarz przeciwciała drugorzędowego. Natomiast aby uniknąć endocytozy i regeneracji receptorów Fc na żywych komórkach, należy przeprowadzić inkubację w
4 °C w buforze zawierającym 5% normalnej surowicy z azydkiem sodu hamującym metabolizm.
Uwaga: Nie należy używać surowicy normalnej lub przeciwciał IgG pochodzących z tego samego gospodarza co przeciwciało pierwszorzędowe, ponieważ zastosowane później przeciwciało drugorzędowe będzie rozpoznawało również immunoglobuliny z surowicy normalnej, powodując większe tło.
Surowicza albumina wołowa (BSA) oraz odtłuszczone mleko w proszku są powszechnie stosowane do blokowania i mogą zawierać bydlęce IgG. Wiele drugorzędowych przeciwciał, takich jak przeciwciała anty-bydlęce, anty-kozie i anty-owcze będą silnie reagowały z bydlęcymi IgG, dlatego korzystanie z BSA lub odtłuszczonego mleka do blokowania lub rozcieńczania tych przeciwciał może znacząco zwiększać tło i/lub redukować miano przeciwciał. Tym samym do blokowania należy używać surowicy normalnej (5%) pochodzącej z tego samego gatunku co gospodarz przeciwciała drugorzędowego.
Fragmenty Fab są uzyskiwane przez trawienie papainą kompletnych przeciwciał IgG w celu usunięcia całego fragmentu Fc, w tym regionu zawiasowego. Przeciwciała te są monowalentne, czyli zawierają pojedyncze miejsce wiązania antygenu. Masa cząsteczkowa każdego z fragmentów Fab wynosi około 50 kDa. Mogą być one stosowane do blokowania endogennych immunoglobulin na komórkach, tkankach lub innych powierzchniach oraz do blokowania odsłoniętych immunoglobulin w badaniach wykorzystujących znakowanie wielokrotne przy użyciu przeciwciał pierwotnych pochodzących z tego samego gatunku.
W przeciwieństwie do tego, diwalentne przeciwciała (całe IgG lub fragmenty F(ab’)2) nie powinny być używane do blokowania, ponieważ mają dwa miejsca wiązania. Po blokowaniu niektóre miejsca wiązania będą dostępne do wychwytywania przeciwciał pierwotnych wprowadzanych w następnym etapie, co będzie wiązało się z wyższym tłem i/lub przypadkowym znakowaniem.
Wyjaśnienia stosowanych opisów
Poniższe wyjaśnienia pojęć mogą pomóc w wyborze najbardziej odpowiednich przeciwciał.
Immunoglobuliny pochodzące z różnych gatunków mają podobną strukturę, co jest związane z ich bliskością filogenetyczną. Przeciwciała przeciw immunoglobulinom z jednego gatunku, mogą więc reagować krzyżowo z wieloma innymi gatunkami, chyba że zostały poddane adsorpcji względem przeciwciał pochodzących z gatunków mogących wykazywać reaktywność krzyżową. Przeciwciała poddane temu procesowi będą zawierały w swoim opisie następujący zapis „(min X…Sr Prot)”.
| – Anti-IgG (H+L) | – Anti-IgG (H+L) Przeciwciała te reagują zarówno z ciężkimi jak i lekkimi łańcuchami cząsteczki IgG, to jest zarówno z regionami Fc jak i F(ab’)2/Fab. Przeciwciała anty-IgG (H+L) reagują również z innymi klasami immunoglobulin (IgM, IgA, IgD, IgE) i podklasami ponieważ wszystkie mają te same łańcuchy lekkie (kappa i lambda). Przeciwciała anty-IgG (H+L) mają szerszy zakres rozpoznawania epitopów niż przeciwciała specyficzne do określonego regionu, dlatego zalecane są do wszystkich ogólnych procedur immunodetekcji. |
| -Anti-IgG, Fc/Fcγ fragment specific | To przeciwciała reagujące z fragmentem Fc łańcucha ciężkiego IgG. Były testowane w teście ELISA i/lub poddane selekcji negatywnej względem fragmentów Fab. W niektórych przypadkach są one dodatkowo testowane i/lub poddawane adsorpcji by zminimalizować reaktywność krzyżową z IgM i/lub IgA. W takich przypadkach przeciwciała (anty-ludzkie, anty-mysie, anty-szczurze) są oznaczone jako „Anti-IgG, Fcγ”. Uwaga: Przeciwciała anty-IgG specyficzne do fragmentów Fcγ mogą reagować niejednakowo ze wszystkimi monoklonalnymi przeciwciałami pierwszorzędowymi. W przypadku przeciwciał anty-mysich IgG specyficznych do fragmentu Fcγ ze zrównoważoną reaktywnością dla czterech podklas IgG należy wybrać kozie anty-mysie IgG (podklasy 1+2a+2b+3), rozpoznające fragment Fc (min X Hu, Bov, Rb Sr Prot). |
| -Anti-Mouse IgG, Fcγ Subclass specific | Przeciwciała te reagują z fragmentem Fc łańcucha ciężkiego poszczególnych podklas IgG myszy. Zostały przetestowane w teście ELISA i/lub poddawane adsorpcji w celu minimalizacji reaktywności krzyżowej z innymi podklasami, fragmentami Fab, IgA, IgM, i IgG kilku innych gatunków. Anty-mysie IgG, rozpoznające fragment Fcγ danej subklasy są przeznaczone do różnicowania podklas mysich pierwotnych IgG w badaniach wykorzystujących znakowanie wielokrotne lub do określenia podklasy IgG. |
| -Anti-IgG, F(ab’)2 fragment specific | To przeciwciała reagujące z fragmentami F(ab’)2 / Fab, które zostały przetestowane w teście ELISA i/lub poddawane adsorpcji przeciwko fragmentom Fc. Nie są specyficzne wyłącznie dla IgG ponieważ reagują z łańcuchami lekkimi, a zatem reagują z innymi klasami immunoglobulin (IgA, IgM, IgD i IgE) i subklasami o takich samych łańcuchach lekkich. |
| -(min X …………….. Sr Prot) | Przeciwciała drugorzędowe skierowane przeciwko jednemu gatunkowi mogą reagować krzyżowo z innymi gatunkami, o ile nie zostały poddane selekcji negatywnej. Przeciwciała z zapisem „(min X … Sr Prot)” w opisie, są testowane i/lub poddawane adsorpcji przeciwko IgG i/lub białkom surowicy gatunków wskazanych w nawiasach. Zaleca się je w przypadku obecności immunoglobulin innych gatunków, które mogą prowadzić do zakłócających reakcji krzyżowych. Jednakże, należy zachować ostrożność przy wyborze przeciwciała, które było poddane adsorpcji przeciwko blisko spokrewnionym gatunkom ponieważ mają one znacznie zmniejszony zakres rozpoznania epitopów co może mieć znaczenie w przypadku wykrywania niektórych przeciwciał monoklonalnych. Na przykład, należy używać jedynie anty-mysich IgG poddanych adsorpcji przeciw szczurzym IgG do wykrywania pierwotnych przeciwciał mysich w tkankach szczurzych zawierających endogenne immunoglobuliny szczurze, lub w znakowaniu wielokrotnym w których stosuje się również szczurze przeciwciała pierwotne. W przypadku braku obecności immunoglobulin szczurzych zaleca się stosowanie anty-mysich IgG nie poddawanych adsorpcji przeciw szczurzym IgG. Dwa inne przykłady przeciwciał, które mają zmniejszony zakres rozpoznawania epitopów po adsorpcji z blisko spokrewnionymi gatunkami to anty-szczurze IgG (min X … Mouse … Sr Prot) i anty-Amerian Hamster IgG (min X … Mouse, Rat … Sr Prot). Szczegółowe informację dostępne w dziale „Znakowanie wielokrotne”.W nawiasach stosowane są następujące skróty: Bov = BovineCk = ChickenGt = GoatShp = SheepProt = ProteinGP = Guinea PigSy Hms = Syrian HamsterHrs = HorseSw = SwineHu = HumanMs = MouseRb = RabbitSr = Serum |
| -ML (multiple labeling) | Niektóre przeciwciała są oznaczone symbolem „ML”, aby podkreślić ich użyteczność również w znakowaniu wielokrotnym. Dalsze informacje są dostępne w dziale „Znakowanie wielokrotne”. |
