Stosując płytki 96 dołkowe w technikach ELISA czasami można zaobserwować, że odczyty absorbancji w dołkach peryferyjnych są wyższe lub niższe od tych, które stwierdza się w dołkach położonych w części środkowej. To zjawisko nazywa się efektem “krawędzi”.

Powodem takich zajwisk mogą być:

1. Ekspozycja na światło substratu reakcji enzymatycznej , jak np. H₂O₂/OPD.

Gdy światło operuje z jednej strony płytki w czasie reakcji substratu peryferyjne dołki płytki, które są najbliżej źródła światła dadzą wysoką absorbancję.

2. Różnice temperatur (najczęstszy powód występowania efektu “krawędzi”).

Wielokrotnie spotykanym błędem w technikach ELISA jest zastosowanie reagentów prosto z lodówki, a następnie ich użycie w inkubacji w temperaturze 37^oC lub nawet temperaturze pokojowej. Ta różnica temperatur i krótki czas inkubacji mogą doprowadzić do utraty homogenności testu. Pierwsze ogrzaniu ulegną peryferyjne dołki płytki z powodu ich bliskości kontaktu z ciepłą półką inkubatora. To z kolei spowoduje, że więcej cząstek może zostać przechwyconych i w rezultacie dać wyższe odczyty absorbancji.

3. Położenie płytek.

Efekt “krawędzi” może wystąpić lub zostać spotęgowany również w przypadku gdy poddane inkubacji płytki umieszczone są jedna na drugiej. Efektowi temu szczególnie poddane są te płytki, które umieszczone są w środkowej warstwie. Docieranie do nich cieplejszej temperatury będzie zahamowane przez położone nad i pod nimi pozostałe płytki.

UWAGI TECHNICZNE

Dla optymalnego ustawienia reakcji immunoenzymatycznej szczególnie ważnym parametrem jest znajomość relacji pomiędzy rozmiarem naczynia a objętością dodawanego płynu.

Płytki Nunc-Immuno, TSP, probówki dostępne są w formacie PolySorp (powierzchnia hydrofobowa) lub MaxiSorp (powierzchnia częściowo hydrofilowa).

Poszczególne typy naczyń charakteryzują się zależną od rozmiaru powierzchni pokrytej cieczą całkowitą zdolnością wiązania. Na podstawie tego parametru istnieje możliwość określenia ilości np. białka i objętości w jakiej musi zostać ono dodane do naczynia aby doszło do saturacji miejsc wiązania.

Używając szacunkowych ocen, że powierzchnia może adsorbować 400ng białka na cm², ze stosunku objętość/powierzchnia (R) można obliczyć stężenie (S) białka jakie należy użyć dla saturacji miejsc wiązania: S=0.4xR mg/ml. Im większy stosunek objętość/powierzchnia tym więcej białka może ulec związaniu.

Parametr R jest również relatywną miarą dystansu jaką reagenty muszą pokonać aby były związane z powierzchnią. To z kolei decyduje o czasie w jakim to zjawisko nastąpi. Ogólnie mówiąc, im większy jest parametr R tym krótszy jest dystans i czas reagentu dla związania się z powierzchnią naczynia.

Zalety wyższych wartości relacji objętość/powierzchnia znalazły swoje zastosowanie w probówkach i płytkach typu STAR. W dnie tych naczyń umieszczonych zostało 6 “płetw” w przypadku probówek i 8 w przypadku płytek, które zwiększają parametr R i dodatkowo ułatwiają mieszanie roztworu. To z kolei skraca czas i zwiększa ilość reagentów w wiązaniu się z powierzchnią.

Parametr “wysokość słupka cieczy” może być użyty do kalkulacji wolnej objętości dla dodania dodatkowej ilości cieczy (np. w dodaniu roztworu hamującego reakcję w ELISA) oraz dla określenia intensywności reakcji barwnej gdy używa się metod, których końcowym etapem jest odczyt na spektrofotometrze. W przypadku probówek trzeba zadbać o to aby wysokość słupka cieczy była powyżej przechodzącego strumienia światła używanego przez dany spektrofotometr.

W załączeniu tabela ze szczegółową charakterystyką produktów NUNC-IMMUNO.